A1: 目前培養(yǎng)的類器官主要來源于上皮細胞，對于非上皮細胞來源的類器官培養(yǎng)方式還需要進一步研究。

A2: 常見的類器官根據(jù)起始細胞的類型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；

（2）干細胞來源的類器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。

A3: 類器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質的起始細胞進行分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝的結構，自組裝后的形態(tài)和功能與體內相應器官相似。

A4：可以的。已有學者驗證過，將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復蘇和原代細胞提取，分別對細胞進行2D和3D培養(yǎng)，證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。

當然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據(jù)實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養(yǎng)的最佳選擇。

A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。

A6：是的，主要的原因是類器官內部缺乏循環(huán)系統(tǒng)。

當類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。因此這個結構尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養(yǎng)的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內。未來的類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，用以培養(yǎng)出更大尺寸的類器官。

A7：類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次^【3】。

A8：大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續(xù)傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度^【4】。

A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態(tài)；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

A10: 在進行類器官培養(yǎng)前，我們需要了解該器官在體內的發(fā)育過程，及早期發(fā)育相關的信號通路。

以胃類器官培養(yǎng)為例：胃由前后腸發(fā)育而來，早期發(fā)育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式，指導激活/抑制相應的信號通路，來達到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化^【5】。

A1: 類器官是由不同類型的細胞組成的結構，并且在體外是自組裝的，因此很容易存在同一樣本在相同培養(yǎng)條件下的孔間差異。

如果是用于患者個性化醫(yī)療的腫瘤類器官，需要更精準地模擬患者體內的特征，這種情況建議采用多個平行來減小差異；

如果是用于機制研究或用作疾病模型的類器官，可以考慮利用“微流控液滴技術”進行工程化培養(yǎng)，相關成果已發(fā)表在Cell Reports Medicine^【1】。

A2：已有動物實驗證實過可行性，比如：腸類器官移植小鼠治療潰瘍性結腸炎^【2】；胰島類器官移植小鼠治療糖尿病^【3】。

雖然目前類器官移植尚未進入臨床，但在2021年2月，Science^【4】首次報道了利用膽道類器官修復離體條件下的人類肝臟，實現(xiàn)了膽道再生，并改善了膽汁性質。

A3：這個問題可以在Nature Protocols^【5】找到答案。

對于新鮮培養(yǎng)的類器官：建議對低代次類器官（2-3代）進行藥物篩選，以最大限度地減少使用過的培養(yǎng)基或體外突變累積對藥物測試的影響。

對于經(jīng)過凍存的類器官：由于冷凍/解凍可能導致復蘇時器官樣形態(tài)的變化，因此建議類器官至少傳代一次再進行藥物篩選。如果出現(xiàn)復蘇后細胞活力不佳，則需要延長培養(yǎng)時間以恢復細胞狀態(tài)。

A4：1、判斷形態(tài)。顯微鏡下類器官形態(tài)可能為空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等，但整體形態(tài)一致。

2、可以鑒定相應的biomarker是否有表達，及分布是否與組織切片相似。

3、是否能夠傳代3次以上，并可以凍存復蘇。

4、如果有條件的話，可以進行測序分析。

A5：可以，干細胞來源類器官的基因編輯多用于疾病建模，而腫瘤來源的類器官則多用于尋找疾病相關突變點或治療靶點，圖1列舉了類器官基因編輯的部分研究和應用。

A6：1、細胞來源有區(qū)別：類器官的細胞來源是具有多能性的上皮細胞，而普通細胞培養(yǎng)適用于培養(yǎng)多種類型細胞；

2、 細胞培養(yǎng)方式不同：1）類器官需要基質膠等材料支撐其三維結構，普通細胞培養(yǎng)則不需要；2） 類器官需要實現(xiàn)體外分化和自組裝，因此需要多種細胞因子的組合進行誘導，培養(yǎng)基成分復雜。而普通細胞培養(yǎng)通常為單一種類細胞，因此培養(yǎng)基成分較簡單；

A7：通常來講，如果腫瘤發(fā)生了轉移，我們依然選用相對應的原發(fā)灶（A類型）PDO培養(yǎng)基。

A8：類器官的分化方式本質上是在模擬體內的器官發(fā)育，因此表達形態(tài)及各細胞分布情況與實際器官具有相似性，而細胞團則沒有這種規(guī)律。我們可以通過免疫熒光的方式檢測biomarkers的分布情況來區(qū)分。例如下圖中的結果表明，腎類器官與腎組織的biomarkers分布高度一致^【7】。

A9：由于類器官涉及到體外分化和自組裝，因此來源細胞必須具有多能性。正常組織的成熟體細胞中往往會有一部分成體干細胞（標志物為Lgr5，CD133等），這部分細胞也可以進行類器官培養(yǎng)。

A10：依據(jù)Hans Clevers實驗室早期發(fā)表的文章，可以采用條件性培養(yǎng)基代替純化的細胞因子進行類器官培養(yǎng)，但同時也需要考慮條件性培養(yǎng)基的不足之處。小編總結了條件性培養(yǎng)基和近岸細胞因子的參數(shù)差異。

A2：考慮到DMSO這類有機物的細胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。

A3：黑色小顆粒大概率是雜質或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：

1、將類器官消化下來，用培養(yǎng)基進行反復清洗，達到稀釋雜質的作用；

2、用無菌手術刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養(yǎng)基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質^【2】。

A4：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優(yōu)勢，通常有以下兩種結合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。

1、PDO-PDX是性價比更高的方式，即：先利用PDO進行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進行PDX測試。

2、PDX-PDXO是更精準的藥物測試方式，即：先利用PDX產(chǎn)生大量的體內腫瘤，然后將這些腫瘤分離進行PDXO培養(yǎng)，此時可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實驗結果與體內用藥結果一一對應，進而預測人體用藥的結果，實現(xiàn)對患者更精準的用藥指導；并且可以用PDX模型將轉移后的腫瘤分離，同樣進行PDXO培養(yǎng)和用藥，能夠更精確地對轉移灶進行藥物篩選。

A5：1、將類器官放置在冰上，待基質膠融化后離心進行回收，這種方式適用于不需要將類器官結構完全打散的情況；

2、市售的細胞回收液，可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。

A6：基質膠能夠為類器官提供支撐作用，目前類器官培養(yǎng)用的基質膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長因子、類胰島素生長因子、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質。由于基質膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質膠替代方案的研究，如圖2^【3】。

A7：1、根據(jù)所模擬的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類器官的培養(yǎng)傾向于利用氣-液交互法來培養(yǎng)^【4】；

2、考慮所培養(yǎng)的類器官模型的應用方向，例如：氣-液交互法培養(yǎng)易于進行病毒感染實驗，因此用于病毒感染實驗的氣道類器官會優(yōu)先選擇氣-液交互法培養(yǎng)^【5】。

A8：藥物篩選前，通常將類器官吹散后，用含2%-5%基質膠的培養(yǎng)基懸浮，并最終鋪在基質膠包被的孔板中^【6-7】。

A9：建議采用水平轉子代替角轉子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。

A10：1、抗體藥物因為需要免疫細胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構建腫瘤類器官-腫瘤微環(huán)境的模型來實現(xiàn)；

2、由于腫瘤類器官中沒有對血管進行培養(yǎng)，因此抗血管類的藥物也同樣不能進行篩選。