酵母雙雜交系統(tǒng)，又稱蛋白阱捕獲系統(tǒng)，是由Fields和 Song等人根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)創(chuàng)建的。利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能、篩選藥物作用位點(diǎn)及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應(yīng)用廣泛。

原理

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程的認(rèn)識。真核生物中基因轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄因子通常含有兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合域(BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)，只有當(dāng)這兩種結(jié)構(gòu)域共同作用時(shí)才能使轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。

利用此特性，可以分別使BD與AD同“誘餌”蛋白(X)和“獵物”蛋白(Y)形成融合蛋白，一般把用來進(jìn)行篩選的目的蛋白稱為“誘餌”蛋白，而篩到的陽性克隆稱為“獵物”蛋白。單獨(dú)的BD與AD蛋白質(zhì)游離于細(xì)胞中不同的位置而分開，不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。如果兩種蛋白X和Y可以發(fā)生相互作用，就能使BD與AD在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。判斷通過報(bào)告基因表達(dá)與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用

如何判斷是否存在相互作用？

報(bào)告基因作為一種營養(yǎng)標(biāo)記，常用的有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等，對應(yīng)的宿主菌則是相應(yīng)標(biāo)記的缺陷型細(xì)胞，必須要在含有該營養(yǎng)標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長。因此，當(dāng)有相互作用的蛋白存在時(shí)，激活報(bào)告基因的表達(dá)，從而能夠在不含營養(yǎng)標(biāo)記的培養(yǎng)基中生長，以此驗(yàn)證是否存在相互作用。

組成部分

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)重要元件組成：

與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）融合的蛋白表達(dá)載體（BD-X），被表達(dá)的蛋白稱為誘餌蛋白（bait）或稱為誘餌，通常誘餌蛋白為已知蛋白。

與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合的蛋白表達(dá)載體（AD-Y），被其表達(dá)的蛋白稱為靶蛋白（prey）或稱為獵物，靶蛋白可以為cDNA文庫、基因片段或基因突變體等。

帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。

常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等，而菌株則需具有相應(yīng)的缺陷型（如果報(bào)告基因?yàn)镠IS3，則菌株應(yīng)為HIS3的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上帶有特定的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記），一個(gè)菌株可以含有1個(gè)、2個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因。

應(yīng)用

(1) 檢驗(yàn)一對已知蛋白(或結(jié)構(gòu)域)間的相互作用；

(2) 用已知功能的蛋白基因篩選 cDNA 文庫，尋找互作蛋白，根據(jù)釣到的基因功能推測該新基因作用網(wǎng)絡(luò)。

酵母雙雜交系統(tǒng)主要應(yīng)用于快速驗(yàn)證已知蛋白之間的相互作用或?qū)ふ倚碌南嗷プ饔玫鞍踪|(zhì)，尤其在尋找蛋白質(zhì)互作區(qū)域時(shí)相當(dāng)有優(yōu)勢。

其優(yōu)點(diǎn)有：

(1)采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使目的蛋白過量表達(dá)，方便復(fù)合物的形成；

(2)篩選過程在真核酵母活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，一定程度上反映了體內(nèi)的真實(shí)情況；

(3)檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的級聯(lián)效應(yīng)，通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用，而細(xì)胞內(nèi)的免疫共沉淀依賴于兩個(gè)互作蛋白質(zhì)的解離程度，因?yàn)樵诿庖叱恋淼倪^程中通過洗滌的過程降低了互作信號；

(4)文庫來源廣泛，可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和特殊分化時(shí)期材料構(gòu)建成cDNA文庫。

缺點(diǎn)有：目前的酵母雙雜交方法存在操作復(fù)雜，假陽性和假陰性多，結(jié)果主要為定性數(shù)據(jù)，不易精確判斷蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度等問題。酵母雙雜交結(jié)果需要再用其他方法進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

實(shí)驗(yàn)流程

以GaL4系統(tǒng)為例的酵母雙雜實(shí)驗(yàn)流程

1. 挑活化好的酵母菌株AH109單克隆，接種于5 mL YPDA液體培養(yǎng)基中。

2. 30℃，250 rpm，培養(yǎng)16-18 h。

3. 按每個(gè)反應(yīng)10 mL的菌量計(jì)算所需的培養(yǎng)基體積。將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入適量的YPDA液體培養(yǎng)基，30℃，250 rpm，培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。在30℃時(shí)，酵母約為2.5 h一代，可據(jù)此計(jì)算接入的菌量。

4. 開始收集菌體時(shí)，準(zhǔn)備變性鮭精DNA。沸水浴中煮10 min，隨后立即插冰上備用。

5. 將培養(yǎng)好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 mL離心管中。室溫，4000 rpm，5 min，收集細(xì)胞。

6. 棄上清，1/2體積無菌水重懸菌體。

7. 室溫，4000 rpm，5 min，收集細(xì)胞。棄上清，用1/5體積1×TE/LiAC重懸。

8. 室溫，4000 rpm，5 min，收集細(xì)胞。棄上清，用1/100體積1×TE/LiAC重懸。

9. 30℃，200 rpm，培養(yǎng)30 min（可縮短或取消）。

10. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒：將1 μg質(zhì)粒DNA（共轉(zhuǎn)化時(shí)，兩種質(zhì)粒各為1 μg）及2 μL 10 mg/mL的變性鮭精DNA加入2 mL離心管中，充分混勻，總體積不應(yīng)超過10 μL。

11. 加入100 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞并輕輕混勻，30℃，200 rpm，培養(yǎng)30 min（可縮短或取消）。

12. 加入600 μL PEG/LiAC溶液（40% PEG，1×LiAC，1×TE）。輕輕吹打混勻。30℃，200 rpm，培養(yǎng)30 min-90 min。

13. 加入70 μL DMSO，輕輕顛倒混勻。

14. 42℃水浴中熱激10 min。冰上放置2 min。

15. 室溫，4000 rpm，離心2 min。棄上清，加100 μL無菌水重懸細(xì)胞。

16. 將細(xì)胞懸液各取一半涂于SD/-Trp-Leu和SD/- Trp-Leu- Ade-His平板上。

17. 28℃培養(yǎng)一周后觀察并拍照。