儲(chǔ)存條件： PMSF -20℃避光保存， RIPA裂解液4℃保存， 

簡(jiǎn)介： 

     RIPA 裂解液是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液，裂解得到的蛋白樣品可用于常規(guī)的 Western、IP 等實(shí)驗(yàn)。蛋白樣品可用 BCA Protein Assay Kit (BN27109) 測(cè)定蛋白濃度。 由于含有較高濃度的去污劑，不能用 Bradford 法測(cè)定 RIPA 裂解后的蛋白濃度。RIPA 裂解液 種類很多，根據(jù)其裂解液的強(qiáng)度不同為強(qiáng)、中、弱三類。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)根據(jù)檢測(cè)樣本與檢 測(cè)目的的不同選擇適當(dāng)?shù)牧呀庖骸?nbsp;

    RIPA 裂解液(強(qiáng))（Enhanced RIPA Lysis buffer）主要由 50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS 等組成，并含有多種蛋白酶 抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，維持原有的蛋白間相互作用。含有 PMSF(100mM, 100×)一支。 

本產(chǎn)品僅用于科研領(lǐng)域，不用于臨床診斷。 

使用方法： 

(一) 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞 

    1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室溫溶解混勻，加入 PMSF 使終濃度為 1mM。

    2. 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上 清，留取沉淀。 

    3. 按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 RIPA Lysis Buffer 。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解 15～ 30min，通常裂解液作用于細(xì)胞 1～3 秒內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。通常 6 孔板每孔細(xì)胞 加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。

    4. 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

    5. 進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二) 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 

    1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室溫溶解混勻，加入 PMSF 使終濃度為 1mM。

    2. 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。 

    3. 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的 裂解液的比例，加入 Enhanced RIPA Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔細(xì)胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到 200～250μl。 再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

    4. 10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。

    5. 進(jìn)行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。有效期 12 個(gè)月。

(三) 組織樣本 

    1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻，加入 PMSF 使終濃度為 1mM。 

    2. 把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。 

    3. 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量 控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。 

    4. 按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上 或 4℃裂解 15～30min。 

    5. 步驟 3、4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比 例，加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器 勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。 

    6. 10000～12000g，4℃離心 5～10min (如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。 

    7. 進(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 

注意事項(xiàng)： 

    1. 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。 

    2. 如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。 

    3. 如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞 較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。 

    4. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈 Vortex 使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是 比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

    5. Medium RIPA Lysis Buffer 含有 Leagene 特殊成分，在低溫情況下有可能出現(xiàn)渾濁 現(xiàn)象，可 37℃水浴促其溶解，不會(huì)影響使用效果；溶解時(shí)間不易過長(zhǎng)，避免有效成分失效。 

    6. 裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因 組 DNA 等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以 直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 

    7. 細(xì)胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進(jìn)行。