產品描述:偶聯 anti-GFP 納米抗體的瓊脂糖珠用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。 

產品優(yōu)勢

? 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；

? 高親和力：解離常數達 nM-pM 級別；

? 高載量：20ul 的 beads 懸液可以結合 2-10ug GFP 蛋白； 

? 較短的孵育時間，結合 5-30 min 即可；

應用范圍  

     可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）、酶活性測定、質譜分析等；

特異性  

     可以結合 GFP、EGFP、YFP 和 EYFP、CFP 和 ECFP 等。 

產品特性 

     存儲緩沖液：PBS(含有 20%乙醇)。 保存條件：可在 4℃保存至少 1 個月，在-20 度或-80℃保存 1 年，避免高速離心，干燥和反復凍融。 

實驗原理

實驗步驟： 

收集細胞： 

    每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 的哺乳動物細胞（約一個 10 厘米培養(yǎng)皿）表達綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長培養(yǎng) 基、向培養(yǎng)皿中加入 2 毫升預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，利用細胞刮或胰酶消化的方法收集貼壁細胞，細胞轉移到離心管， 500 g 離心 3-5 分鐘并丟棄上清液。 

細胞裂解：

     1．用 500 ul 預冷的裂解緩沖液重懸細胞，在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑（自備）。對于膜蛋白或核/染色質蛋白， 可使用 RIPA 裂解液（貨號：BN25012）中加入蛋白酶抑制劑（貨號：BN25002）。 

     2．把離心管放置在冰上 30 分鐘，可以每 10 分鐘充分吹打一次。

     3．細胞裂解產物在 4℃，20,000 g 條件下離心 15 分鐘，轉移裂解產物到一個新的預冷管中，丟棄沉淀。注意：此時細胞 裂解產物可以放在-80℃進行長期儲存。 平衡珠子：

     4．振蕩混勻 GFP-Nanobody-Agarose Beads，吸取 20ul beads 懸液到 500 ul 預冷的裂解緩沖液中，在 4 ℃，2,500 g 條 件下離心 3 分鐘，丟棄上清液。（此步驟可選） 

結合蛋白

     5. 將細胞裂解產物加入到平衡的 GFP-Nanobody-Agarose Beads 中（如果未做第 4 步，可在細胞裂解產物中直接加入 20ul beads 懸液），在 4 ℃冷柜中的旋轉混合儀上結合5-30 min。根據實驗需要可延長結合時間以達到更好的結合效果。如果 需要，保存 50 ul 的裂解產物進行免疫印跡分析。 

     6. 在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液。

清洗珠子：

     7. 用 500 ul 預冷的裂解緩沖液中洗滌 GFP-Nanobody-Agarose Beads，在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液并重復洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。

洗脫蛋白： 

方法一： 

     8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重懸 GFP-Nanobody-Agarose Beads。在 95℃條件下加熱 10 min，把免疫沉淀復合物從珠子上游離出來，然后在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘收集上清，進行免疫印跡分析。 

方法二： 

     9. 替代步驟 8 的可選步驟：加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脫結合的蛋白，建議孵育時間 30 秒，并不斷混勻，隨后離心，轉移上清液到新管中，為了中和酸性的甘氨酸，需添加 5ul 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。 

產品效果：