產(chǎn)品描述:偶聯(lián) anti-mCherry 納米抗體的瓊脂糖珠用于免疫沉淀 mCherry 融合蛋白。 

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì) 

? 沒有普通抗體的輕鏈和重鏈； 

? 高親和力：解離常數(shù)達(dá) nM-pM 級(jí)別； 

? 高載量：20 ul 的 beads 懸液可以結(jié)合 2-10 ug mCherry 蛋白； 

? 較短的孵育時(shí)間，結(jié)合 30-120 min 即可； 

應(yīng)用范圍 

     可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）、 酶活性測(cè)定、質(zhì)譜分析等； 

特異性 

     可以結(jié)合 mCherry，也可能結(jié)合 RFP，DsRed 等紅色熒光蛋白。 

產(chǎn)品特性 

     存儲(chǔ)緩沖液：PBS(含有 20%乙醇)。 

     保存條件：可在 4℃保存至少 1 個(gè)月，在-20 度或-80℃保存 2年，避免高速離心，干燥和反復(fù)凍融。 

實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)步驟： 

收集細(xì)胞： 

     每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 106-107 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（約一個(gè) 10 厘米培養(yǎng)皿）表達(dá)綠色熒光蛋白融合蛋白。吸出生長培養(yǎng)基、向培養(yǎng)皿中加入 2 毫升預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，利用細(xì)胞刮或胰酶消化的方法收集貼壁細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管， 500 g 離心 3-5 分鐘并丟棄上清液。 

細(xì)胞裂解： 

     1．用 500 ul 預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞，在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑（自備）。對(duì)于膜蛋白或核/染色質(zhì)蛋白， 可使用 RIPA 裂解液（貨號(hào)：BN25012）中加入蛋白酶抑制劑（貨號(hào)：BN25002）。 

     2．把離心管放置在冰上 30 分鐘，可以每 10 分鐘充分吹打一次。 

     3．細(xì)胞裂解產(chǎn)物在 4℃，20,000 g 條件下離心 15 分鐘，轉(zhuǎn)移裂解產(chǎn)物到一個(gè)新的預(yù)冷管中，丟棄沉淀。注意：此時(shí)細(xì)胞 裂解產(chǎn)物可以放在-80℃進(jìn)行長期儲(chǔ)存。 

平衡珠子： 

     4．振蕩混勻 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 懸液，吸取 20ul beads 懸液到 500 ul 預(yù)冷的裂解緩沖液中，在 4 ℃， 2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液。（此步驟可選） 

結(jié)合蛋白

     5. 將細(xì)胞裂解產(chǎn)物加入到平衡的 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 懸液中（如果未做第 4 步，可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直 接加入 20ul beads 懸液），在 4 ℃冷柜中的旋轉(zhuǎn)混合儀上結(jié)合 30-120 min。如果需要，保存 50 ul 的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫 印跡分析。 

     6. 在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘，丟棄上清液。 

清洗珠子： 

     7. 用 500 ul 預(yù)冷的裂解緩沖液中洗滌 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 懸液，在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘， 丟棄上清液并重復(fù)洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）。 

洗脫蛋白： 

方法一： 

     8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重懸 mCherry-Nanobody-Agarose Beads 懸液。在 95℃條件下加熱 10 min，把免 疫沉淀復(fù)合物從珠子上游離出來，然后在 4 ℃，2,500 g 條件下離心 3 分鐘收集上清，進(jìn)行免疫印跡分析。 

方法二： 

     9. 替代步驟 8 的可選步驟：加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白，建議孵育時(shí)間 30 秒，并不斷混勻，隨后 離心，轉(zhuǎn)移上清液到新管中，為了中和酸性的甘氨酸，需添加 5ul 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可 以重復(fù)這一步。 

產(chǎn)品效果：